Nature子刊：科学家用CRISPR纠正癫痫致病突变

          转载自“神经科技”

    编码Nav1.1通道α亚基的SCN1A基因发生突变，可导致具有各种临床表型的癫痫，这与通道功能缺失或功能获得的对比效果有关。近期，来自中国科技大学、中科院广州生物医药与健康研究院、广州医科大学第二附属医院和中南大学的研究人员，在Nature子刊《Translational Psychiatry》发表题为“CRISPR/Cas9 facilitates investigation of neural circuit disease using human iPSCs: mechanism of epilepsy caused by an SCN1A loss-of-function mutation”的学术成果。在这项研究中，研究人员将近年来迅猛发展的基因组编辑技术与iPSC来源的模型结合起来，纠正了癫痫患者iPSC中的致病突变。

    本文通讯作者是中科院广州生物医药与健康研究院的李志远研究员，其1997年博士毕业于中南大学并赴日本留学，2000年获日本德岛大学博士学位。2000年至2007年先后在美国范德堡大学和圣路易斯大学从事博士后研究工作和助理教授。研究领域主要包括细胞膜离子通道蛋白的研究、P2X受体的结构与功能研究和干细胞的神经分化与电生理研究，研究成果多次发表在Neurosci Lett、Scientific Reports、Stem Cell Research、Journal of neuroscience research等国际学术期刊。

    SCN1A基因突变，可以导致具有广泛临床表型的癫痫，从相对良性的癫痫到更严重的Dravet综合征。有些癫痫如Dravet综合征，产生了治疗耐药性，其余类型癫痫的治疗，主要依赖于抗癫痫药物。目前市场上有超过20种抗癫痫药物可供使用，它们有不同的作用机制和靶标。关于SCN1A所致的癫痫的机制，我们所了解的信息还很有限，这对于医生选择药物协同控制癫痫发作、同时最大限度地减少不良影响，一直都是具有挑战性的。延伸阅读：用人类干细胞衍生的神经元治疗癫痫。

    在转染系统中异源检测到的癫痫SCN1A突变体，显示出不同的电生理学改变，主要可以分为功能缺失突变和功能获得突变。功能缺失突变更为常见，并与癫痫更严重的临床表现有关。目前存在很多种癫痫的动物模型和患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生模型。然而，这些研究对于SCN1A基因有关的任何癫痫的机制，都没有得到深刻的见解。

    这些动物模型主要使用Nav1.1缺失来模仿功能缺失突变。在小鼠大脑中敲除Nav1.1，可导致小脑和海马体中GABA能神经元中的Nav流和兴奋性降低，但兴奋性海马锥体神经元中没有检测到变化。然后，研究人员发现，选择性删除GABA能神经元中的Nav1.1，足以引起小鼠癫痫，并且，在兴奋性神经元中额外删除Nav1.1，可缓解现有的癫痫症状。

    Nav1.1删除的动物模型所产生的这些结果表明，GABA能神经元的功能障碍，可能参与了这种疾病的发生。然而，来自患者iPSC衍生模型的研究结果表明，在假定的抑制性和兴奋性神经元中的钠离子增加，与增加的诱发动作电位（AP）和自发放电有关。理解这些看似矛盾的结果是很困难的；特别是当iPSC衍生模型具有一些固有的局限性。iPSCs提供的系统其中一个最严重的问题是，它不能平衡兴奋性和抑制性神经亚型的矛盾，该模型应该特别关注表达Nav1.1的神经元亚型，以确定突变的直接影响，并确定疾病的起源。

    癫痫发作，是由于神经抑制与兴奋之间的失衡，包括两种神经亚型以及它们通过突触连接的相互作用。在大脑中，Nav1.1主要在GABA能神经元以及一小部分兴奋性椎体神经元中表达。Nav1.1的这个偏置分布表明，该疾病起源于某一亚型，在疾病过程中有两个亚型以不同的方式参与。显然，现有的iPSC衍生模型不能提供一个包含这两种神经元的系统，同时在电生理学研究中可允许区分不同的亚型，并集中在表达Nav1.1的亚型。此外，iPSC衍生模型是基于不同遗传背景之间的比较，但是据报道，遗传背景能够调节癫痫病的严重程度，这可能会进一步影响到我们对“所观察到的疾病相关差异”的认识。

    在这项研究中，研究人员将CRISPR/Cas9和TALEN介导的基因编辑技术，应用于iPSC为基础的疾病模型，来探讨SCN1A功能性缺失突变所致的癫痫发病机制。通过利用CRISPR/Cas9对iPSC衍生的神经元中的GABA能神经元亚型进行荧光标记，研究人员首次对表达SCN1A的神经亚型进行了电生理学研究，并监测了抑制性和兴奋性类型的突触后活动。

    研究人员发现，突变c.a5768G，可导致外源性转染系统中没有Nav1.1流，不仅影响Nav电流量的性质，而且也影响表达Nav1.1的GABA能神经元的Nav激活。Nav的两个变化，进一步减少了幅度，并增强了患者来源的GABA能神经元的动作电位阈值，导致患者来源的神经元网络中的自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）减弱。

    虽然自发的兴奋性突触后电流（sEPSCs）变化不明显，但是，当进一步分析sIPSCs和sEPSCs的频率之后，研究人员发现，整个突触后活动从抑制为主的状态转化为患者来源的神经元网络的激发态，这表明，仅仅sIPSCs的变化就足以显著逆转自发性突触后活动的兴奋性水平。

    总之，这些研究结果填补了我们对于“SCN1A突变对转染外源性细胞的影响和对表达nav1.1的神经元的影响之间的关系”的认识上的空白，并揭示了SCN1A功能缺失突变所致的癫痫发生的根本生理学机制。

原文信息

CRISPR/Cas9 facilitates investigation of neural circuit disease using human iPSCs: mechanism of epilepsy caused by an SCN1A loss-of-function mutation

Abstract: Mutations in SCN1A, the gene encoding the α subunit of Nav1.1 channel, can cause epilepsies with wide ranges of clinical phenotypes, which are associated with the contrasting effects of channel loss-of-function or gain-of-function. In this project, CRISPR/Cas9- and TALEN-mediated genome-editing techniques were applied to induced pluripotent stem cell (iPSC)-based-disease model to explore the mechanism of epilepsy caused by SCN1A loss-of-function mutation. By fluorescently labeling GABAergic subtype in iPSC-derived neurons using CRISPR/Cas9, we for the first time performed electrophysiological studies on SCN1A-expressing neural subtype and monitored the postsynaptic activity of both inhibitory and excitatory types. We found that the mutation c.A5768G, which led to no current of Nav1.1 in exogenously transfected system, influenced the properties of not only Nav current amount, but also Nav activation in Nav1.1-expressing GABAergic neurons. The two alterations in Nav further reduced the amplitudes and enhanced the thresholds of action potential in patient-derived GABAergic neurons, and led to weakened spontaneous inhibitory postsynaptic currents (sIPSCs) in the patient-derived neuronal network. Although the spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) did not change significantly, when the frequencies of both sIPSCs and sEPSCs were further analyzed, we found the whole postsynaptic activity transferred from the inhibition-dominated state to excitation in patient-derived neuronal networks, suggesting that changes in sIPSCs alone were sufficient to significantly reverse the excitatory level of spontaneous postsynaptic activity. In summary, our findings fill the gap of our knowledge regarding the relationship between SCN1A mutation effect recorded on exogenously transfected cells and on Nav1.1-expressing neurons, and reveal the physiological basis underlying epileptogenesis caused by SCN1A loss-of-function mutation.